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細胞低血清馴化技術

日期:2019-05-16 23:11
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摘要:BHK21細胞和Vero細胞可以使用低血清培養基進行細胞的培養,通常細胞需要進行低血清馴化過程。對于細胞低血清馴化一般有兩種方法,直接適應和間接適應。直接適應是指棄去原細胞培養液,直接使用低血清培養基添加低濃度血清培養,操作簡單,但由于直接適應細胞生長環境變化較為明顯,馴化過程中需注意的事項較多,而且細胞馴化的效果與細胞的特性有很大關系;間接適應一種方法是使用原培養液和低血清培養液混合使用,在傳代的過程中逐漸增大低血清培養液的比例,另一種方法是使用低血清培養基添加常規血清量培養細胞,在傳代過程中逐漸降低血清的使用量,該適應方法雖然繁瑣,但通常細胞馴化效果較好。BHK21細胞即可使用直接適應法馴化,也可使用間接適應法進行馴化。Vero細胞通常使用直接適應法進行細胞馴化。

細胞低血清馴化技術

細胞低血清馴化的理論基礎

根據培養物的不同,細胞培養可分為原代培養(包括從組織塊開始的原代培養和從細胞懸液開始的原代培養)和傳代培養兩大類。通過各種傳代培養的方法,可以得到各種細胞系、細胞株,克隆等細胞的傳代培養物。據國際組織培養學會專業術語委員會規定,原代培養物在首次傳代后即成為細胞系,在一個細胞系中,由于細胞來自原代培養物中的不同的細胞譜系,并非所有的細胞均具有相同的分化標志和特性。通過克隆形成法或各種選擇培養法,有可能從原代培養物或細胞系中把那些具有共同特性或分化標志的細胞群體分離出來,形成細胞株。細胞克隆是單個細胞通過有絲分裂所形成的細胞群體,是細胞株的特殊情形。一個克隆中的細胞在遺傳性上不一定是均質的,如腫瘤細胞的克隆由于不均質分裂在遺傳性上就是不均質的。由此可見,有組織分離的原代細胞培養物,經傳代為細胞系以及細胞株,培養物中的細胞基因會發生改變,即細胞培養物隨培養過程發生的基因變異性。另外,不管細胞系還是細胞株,甚至細胞克隆,細胞群體中的細胞基因并非是一致的,即存在細胞培養物的非均質性現象。這些為細胞培養的適應、篩選、馴化提供了理論基礎。
BHK21細胞和Vero細胞,做為來源于正常細胞轉化的傳代細胞系,同樣也存在群體細胞的非均質現象。由于不同的培養條件或傳代的過程不同,BHK21細胞和Vero細胞會形成培養特性的差異。因此,在不同的企業或實驗室,經??梢姷郊毎螒B、細胞貼壁性、細胞生長特性等方面存在差異的BHK21細胞和Vero細胞。正是由于BHK21細胞傳代過程的非均質性,使用降低血清含量的方法進行細胞的傳代培養,可得到適應于低血清培養的BHK21細胞培養物。
體外培養的細胞形態,概括說來可分為兩類,一類是以上皮細胞或類上皮細胞為代表的器官專一細胞(即器官實質細胞),一類是以成纖維細胞或成纖維樣細胞為代表的間葉細胞。典型的體外上皮細胞在光學顯微鏡下為正方形或六角形,細胞緊密相連長成一片,核質比值較高??蓞^分為正常上皮細胞和腫瘤上皮細胞兩種。絕大部分體外上皮細胞只能在原代培養物中存活很短一段時間,不能傳代。少數體外上皮細胞可以因為條件適合傳代下去,甚至形成一個連續的細胞株系。迄今為止,形成連續系的細胞幾乎都是腫瘤上皮細胞。典型的成纖維細胞在光學顯微鏡下呈細長形或梭形,細胞較為疏松地長成一片,或平行成束,或交叉成網,其形態可因培養基及細胞密度的不同而不同。某些類型的成纖維樣細胞可以分泌膠原、透明質酸和硫酸軟骨素等。一般說來,成纖維細胞在體外生存的期限雖比正常上皮長一些,但亦極為有限。在少數情況下,生長漸趨停止的成纖維樣細胞,在一定時期之后,可突然又重趨活躍,并不斷增殖為可以連續傳代的細胞系,其細胞可以在體內形成腫瘤,此種現象稱為自發新生性轉化,多見于嚙齒動物的成纖維細胞,尤多見于小鼠的成纖維樣細胞。在BHK21細胞和Vero細胞低血清培養過程中,由于血清含量的降低,以及細胞培養條件的改變,與傳統的高含量血清培養比較,細胞的形態會發生或多或少的改變,這是正?,F象,不影響細胞的低血清傳代效果。


 BHK21細胞和Vero細胞的低血清馴化
BHK21細胞和Vero細胞可以使用低血清培養基進行細胞的培養,通常細胞需要進行低血清馴化過程。對于細胞低血清馴化一般有兩種方法,直接適應和間接適應。直接適應是指棄去原細胞培養液,直接使用低血清培養基添加低濃度血清培養,操作簡單,但由于直接適應細胞生長環境變化較為明顯,馴化過程中需注意的事項較多,而且細胞馴化的效果與細胞的特性有很大關系;間接適應一種方法是使用原培養液和低血清培養液混合使用,在傳代的過程中逐漸增大低血清培養液的比例,另一種方法是使用低血清培養基添加常規血清量培養細胞,在傳代過程中逐漸降低血清的使用量,該適應方法雖然繁瑣,但通常細胞馴化效果較好。BHK21細胞即可使用直接適應法馴化,也可使用間接適應法進行馴化。Vero細胞通常使用直接適應法進行細胞馴化。
BHK21細胞細胞馴化的效果與使用的BHK21細胞株有很大的關系,有些BHK21細胞很容易馴化,而另一些BHK21細胞則馴化比較困難,另外,細胞馴化時的狀態與活力、細胞致密度、細胞代次、細胞消化程度等均對細胞馴化有影響。 Vero細胞與BHK21細胞相比,更容易進行細胞的低血清馴化。
進行細胞馴化時,應挑選形態良好、生長旺盛、形成良好單層的細胞作為馴化對象,這樣的細胞由于正處于對數生長期,細胞活力強,貼壁性好,對血清含量的降低更具有耐受性,有利于細胞馴化的順利進行。細胞馴化過程中,控制細胞良好的貼壁十分重要,由于細胞在靜止培養時更容易貼壁,所以*初的細胞馴化時應當在方瓶中進行,而不建議直接用轉瓶進行馴化,但Vero細胞也可直接使用轉瓶進行細胞馴化。


細胞低血清馴化程序
Ø 棄原培養液,換新鮮低血清培養基添加10%血清培養,待細胞成致密單層后,使用含10%血清的低血清培養基傳代培養;
Ø 待細胞成良好致密單層時,對細胞進行傳代,降低血清使用量至5-8%,使用該濃度血清連續傳代2-3次,然后繼續降低血清使用量;
Ø 待細胞生長增殖、貼壁率等與使用高濃度血清培養效果無顯著差異時,繼續傳代,降低血清濃度至3%;
Ø 一般使用3%血清血清培養基培養3-4代,細胞即可適應低血清培養,當細胞生長增殖速率與高濃度血清培養時效果基本相當時,即可認為細胞馴化完成;
Ø 擴增馴化適應低血清培養的細胞,使用含10%DMSO和20%血清的低血清培養基凍存細胞建庫,馴化完成的細胞復蘇時即可使用3-5%血清的低血清培養基進行培養,經2-3代培養細胞生長增殖速率恢復至凍存前水平。

BHK21細胞低血清馴化效果
本實驗室采用分階段馴化法馴化BHK21細胞,適應 MD611低血清培養基,經5~6代后細胞逐漸適應,并建立低血清BHK21細胞種子庫。已適應MD611的BHK21細胞在血清含量大于2%的情況下均能穩定傳代。使用MD611培養基,在T25細胞培養瓶中,低血清(3%血清含量)培養該低血清適應細胞,細胞輪廓清晰并具有較強立體感,形態良好,細胞生長旺盛,可以大分種比例進行細胞傳代培養。以1:10分種比例進行細胞傳代培養,接種培養4小時,細胞開始貼壁伸展;培養18小時,細胞進入快速生長期;培養24小時,生長為單層細胞;培養48小時,細胞生長為致密單層。
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BHK21細胞培養4小時                                     BHK21細胞培養18小時

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BHK21細胞培養24小時                                       BHK21細胞培養48小時

 
中農威特生物技術股份有限公司的劉學榮等人,使用T25細胞培養瓶對BHK21細胞進行了低血清適應研究,使用含10%小牛血清的MEM和乳漢液混合培養液做為試驗對照。試驗分兩個步驟進行,首先在5%血清用量的情況下逐步將BHK21細胞適應低血清培養基,直到細胞完全適應,之后在此基礎上,使用低血清培養基分階段逐漸降低血清的用量,將 BHK21細胞適應于低血清培養環境,當細胞完全適應低血清培養后,凍存細胞建立生產用細胞種子庫。在**個步驟的試驗過程中,替換培養基的初期細胞也有不適應的表現。與對照組相比,細胞的生長延遲期明顯變長;細胞活性由 90%降到40%。細胞還可能出現大量死亡,不能繼續傳代等異?,F象。但在維持5、6代后,細胞逐漸恢復正常。

 

BHK21 細胞適應MD611的生長情況

培養基

201 培養基

50 % 201 + 50 % 611

25 % 201 + 75 % 611

MD 611

小轉瓶

大方瓶

小轉瓶

大方瓶

小轉瓶

大方瓶

小轉瓶

大方瓶

新生牛血清

10%

10%

5%

5%

5%

5%

5%

5%

分種比例

1:5

1:5

1:5

1:5

1:5

1:5

1:5

1:5

pH (接種時)

7.2

7.2

7.2

7.2

7.2

7.2

7.2

7.2

貼壁比例

24h

50%~60 %

50%~60 %

60%~70 %

60%~70 %

60%~70 %

60% ~70 %

60%~70 %

60%~70 %

48h

90%

90%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

72h

100%

100%

大多數細胞開始老化,表面有大量死細胞

96h

變圓,開始脫落

表面死細胞較多,但未脫落

長成單層時間

72h

72h

48h

48h

48h

48h

48h

48h

細胞數量(108)

0.8~0.9

4~5

0.8~0.9

4~5

0.6~0.7

3~4

0.6~0.7

3~4

試驗的第二個步驟,將BHK21細胞依次使用5%、4 %、3%、2%、1 %的血清進行適應培養,試驗標明降血清過程中,*初的3代細胞沒有表現出不適應現象,但在繼續傳代的過程中發現,添加 2%以下血清量的細胞,活性顯著下降、貼壁性差、比生長率降低,很難繼續傳代。因此,選擇4%血清培養的細胞培養條件,篩選出傳代穩定性好、生長較快的細胞適應株,并能連續傳30代。

BHK21 細胞適應低血清培養的生長情況

培養基

201 培養基+10%血清

MD611

+5%血清

MD611+4%血清

MD611+3%血清

MD611+2%血清

MD611

+1%血清

分種比例

1:4

1:4

1:4

1:4

1:4

1:3

pH (接種時)

7.2

7.2

7.2

7.2

7.2

7.2

貼壁比例

24h

60% ~ 70 %

60%~70 %

60%~70 %

60%~70 %

60%~ 70 %

40%~ 50 %

48h

100%

100%

100%

100%

100%

70%~80 %

72h

大多數細胞開始老化,表面有大量死細胞

100 %

96h

細胞開始變圓,開始脫落

細胞數量(107)

2

2.3~2.5

2.1~2.3

2~2.2

1.9~2.1

1.6~1.8

細胞活性

92% ~95 %

92%~95 %

92%~95 %

92%~95 %

92%~95 %

92%~95 %

連續傳代次數

30

30

30

30

30

10

劉學榮等對低血清適應的BHK21細胞進行了進一步的試驗研究和分析。使用MD611培養基對112代BHK21細胞,進行低血清馴化適應,之后繼續用低血清培養基連續傳代30代以上,將該細胞按為1:5分種比例進行細胞傳代,以傳統培養基加10%小牛血清培養的細胞為對照組。試驗組的血清含量分別為5%、4%、3%、2%和1%。其中血清含量為5%的記為Ⅰ組,血清含量為4%的記為Ⅱ組,以此類推,共計五組。試驗結果見下表。

不同血清濃度培養時細胞的生長情況(×107

組別

對照組

細胞接種量

0.462

0.42

0.415

0.403

0.387

0.352

細胞數量(24h)

0.83

0.85

0.764

0.752

0.68

0.62

細胞數量(48h)

1.86

2.42

2.36

2.28

1.84

1.26

細胞數量(72h)

2.51

1.98

2.12

2.04

2.20

1.73

細胞數量(96h)

2.21

1.85

1.87

1.92

1.86

1.65


不同血清濃度對細胞比生長率的影響

組別

對照組

0-24h

0.80

1.02

0.84

0.87

0.76

0.76

24-48h

1.24

1.85

2.09

2.03

1.71

1.03

48-72h

0.35

-0.18

-0.1

-0.11

0.20

0.37

72-96h

-0.12

-0.07

-0.12

-0.06

-0.15

-0.05

不同血清濃度對細胞活性的影響

組別

對照組

24h

95.4%

96.3%

94.6%

97.1%

95.3%

94.5%

48h

96.2%

96.6%

95.2%

95.3%

97.5%

96.2%

72h

93.6%

90.4%

93.6%

94.0%

94.6%

95.5%

96h

88.2%

87.5%

90.4%

89.2%

86.2%

89.4%

試驗結果顯示,已適應MD611培養基BHK21細胞,在血清含量大于2%的情況下均能穩定傳代,并可連續傳代均在30代以上,能夠滿足生產實際需要。添加5%、4%3%血清的試驗組細胞均在48h達到*大量,細胞產量、細胞活性與對照組差異不大;添加2%1%血清的試驗組在72h達到*大量,細胞產量略低于對照組。但當細胞數量達到*大值后,試驗組的細胞開始老化,大量細胞懸浮于培養液中,致使細胞數量減少較快,細胞活性也逐漸降低。BHK21細胞在24-48h生長較快,平均比生長率在1.74d-1以上,高于對照組。

 Vero細胞低血清馴化效果
為了研究血清含量對MD504低血清培養Vero細胞的影響,在T25細胞培養瓶中,我們采用MD504培養基對同一批Vero細胞進行培養,分種比例1:6,血清添加量分別是10%、5%和3%。結果表明,與添加10%NBS的培養基相比,添加5%和3%的細胞輪廓清晰,形態正常,細胞生長旺盛,在早期(24小時以前)細胞生長速度略慢于10%,培養48~72小時,細胞生長為致密單層,細胞密度可達6~7×106 cell/瓶,與添加10%NBS的沒有明顯區別。

3.5-1.jpg3.5-2.jpg

左圖:Vero細胞(T25培養瓶),培養48小時,培養液為含10%血清的MD504培養基
右圖:Vero細胞(T25培養瓶),培養48小時,培養液為含5%血清的MD504培養基

3.5-3.jpg  

左圖:Vero細胞(T25培養瓶),培養48小時,培養液為含3%血清的MD504培養基

同時我們研究了MD504培養基與普通199培養基的使用效果,使用T25方瓶對Vero分種培養,培養結果顯示,與普通199培養基相比,MD504培養的Vero細胞輪廓清晰,生長速度快,48小時形成致密單層,細胞密度達7~8×106 cell/。

3.5-4.jpg     3.5-5.jpg

左圖:Vero細胞(T25培養瓶),培養48小時,培養液為含5%血清的MD504培養基
右圖:Vero細胞(T25培養瓶),培養48小時,培養液為含5%血清的199培養基對照


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